روش جستجو وشمارش كپكها ومخمرها در25درجه سليسيوس

هدف : ارائه روش كلي براي شمارش كپك ومخمر

تعريف : منظور ازكپك ومخمر ميكروارگانيسم هاي هستندكه دردماي 25 درجه سيليسيوس بر روي محيط كشت عصاره مخمر-دكستروز-كلرامفنيكل آگار پرگنه مشخص توليد مي كند .

اساس آزمايش : حجم مشخصي از نمونه مورد آزمون درصورت مايع بودن ياحجم مشخصي ازسوسپانسيوناوليه درمورد فراورده هاي ديگر ومحيط كشت انتخابيبه پليت اضافه مي شود .

پليت ها مدت 3تا4 يا5روز درشرايط هوازي و25درجه سليسيوس نگهداري مي شود .

پرگنه هاي كپك ومخمر بررسي وشمارش مي شود وتعداد آنها در يك گرم يايك ميلي ليتر ازنمونه گزارش مي شود

محيط كشت ومحلولهاي مورد نياز :

عصاره مخمر-دكستروز-كلرامفنيكل آگارYeast extract Dextrose Chloramphenicol Agar

تركيب :

گاهي ممكن است اكسي تتراسايكلين به جاي كلرامفنيكل استفاده شود . محيط رادرمقاد ير 100ميلي ليتري تقسيم وسترون كنيد سپس محلول 0/1 درصد از اكسي تترا سايكيلين هيدرو كلرايت درآب تهيه و توسط صافي سترون نماييد و در هنگام آزمايش 10 ميليليتر از محلول را به 100 ميلي ليتر محيط كشت ذوب شده كه دماي آن در حدود 45 درجه سيليسيوس است اضافه نماييد .

محلول رقيق كننده :

استاندارد شماره 356 ملي ايران

محلول رنگ آميزي : لاكتوفنل كاتن بلو lacto phenol cotton blue  

روش تهيه : ابتدا فنل رابه آب مقطر اضافه نماييد سپس حرارت داده تاكاملا حل شود سپس اسيد لاكتيك وگليسرين را به آن اضافه نماييد وپس ازتهيه محلول لاكتوفنل ،پودر كاتن بلو رابه ان اضافه نماييد وبه آرامي به هم بزنيد .

روش كار : دوپليت استريل به اندازه 90 -100ميلي ليتر برداشته وبطورجداگانه درهر يك يك ميلي ليتر ازنمونه مورد ازمون ، درصورت مايع بودن ويا يك ميلي ليترازسوسپانسيون اوليه رادرموردفراورده هاي ديگراضافه نماييد .(درصورت لزوم همين كاررابراي رقتهاي ديگر انجام دهيد) . سپس 15 ميلي ليتر ازمحيط كشت عصاره مخمر-دكستروز-كلرامفنيكل آگار ذوب شده كه دماي آنرحدود 45درجه سيليسيوس است رابه هريك ازپليت هااضافه نماييد وبه آرامي آنها را مخلوط نماييد . پس ازمخلوط شدن پليت راجهت سرد شدن برروي سطح صاف وخنك قرار دهيد سپس آنها رابه مدت 3 الي 5 روز در25 درجه سليسيوس نگهداري نمائيد .

تفسير نتايج : پرگنه ها رابعد از3تا4 تا5 روز بررسي نموده ونتيجه راپس از5روز درپليت هايي كه كمتراز 150پرگنه دارند شمارش وگزارش كنيد .

مطالعه ميكروسكوپي :

 1- روش خردكردن پرگنه : Teased mount

 توسط سوزن سركج پلاتيني قسمت كوچكي از پرگنه قارچ رابرداشته وبرروي لام حاوي يك قطره محلول لاكتو فنل كاتن بلو قرارداده وبالامل سطح آن رابپوشانيد . سپس رنگ اضافي راخارج نموده ودرزير ميكروسكوپ مورد بررسي قرار دهيد . (دراين روش اغلب ساختار قارچ ازبين مي رود )

 2- روش اسلايد كالچر Slide culture

15ميلي ليتر از محيط عصاره مخمر-دكستروز-كلرامفنيكل آگار رادرون پليت سترون ريخته وپس ازجامد شدنتوسط بيستوري سترون آن رابه قطعات چهارگوش 1در1 سانتي متري تقسيم نماييد . 7الي8 ميلي ليتر آب مقطر سترون به پليت حاوي لوله u شكل كه لامي برروي آن قرارداده شده وازقبل سترون شدهاست اضافه نماييدتارطوبت موردنيازتامين گردد. يك قطعهازمحيط كشت چهارگوش بريده شده رادرشرايط سترون برروي لام درون پليت قرار دهيدووسط چهارضلع محيط كشت راباتكه هاي كوچك پرگنه قارچ موردنظر تلقيح نمائيد، سپس لامل رابرروي محيط كشت قرار داده درب پليت راگذاشته وآن رادردماي25 درجه سيليسيوس نگهداري نماييد . پس ازتشكيل ساختمان قارچ به طريقه زيرعمل نماييد

نمونه تهيه شده ازلامل : توسط پنس لاملي كه دراطراف آن قارچ رشدنموده به آرامي از سطح محيط برداشته وبرروي يك لام تميز حاوي يك قطره لاكتو فنل كاتن بلو قرار دهيد .

نمونه تهيه شده ازلام : محيط كشت راازسطح لام برداريد وداخل پليت بگذاريد ، سپس لام راازپليت خارج كرده ويك قطره لاكتو فنل كاتن بلو رادرمحل رشد پرگنه قارچ اضافه نموده ولاملي رابرروي آن قرار دهيد .درصورت وجود رنگ اضافي درخارج لامل توسط كاغذ خشك كنوبراي مسدود نمودن اطراف لامل ازلاك ناخن وياهرماده مشابه ديگر استفاده نمائيد وزير ميكروسكوپ بررسي نماييد .